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米氏常数测定方法
篇一:origin,米氏方程拟合
酶活米氏常数实验
一、实验前准备
1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。
2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200µL和10µL移液枪、50µL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。 4、记录本上提前写好实验的加样顺序：
催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液 ②10µL催化剂 ③底物TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10µL) ④32µLH2O2（排枪加） 催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液 ②10µL催化剂 ③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64µL） ④10µL底物TMB（ABTS）（排枪加）
数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。 Code Time TMB V01
Code Time H2O2 V01 二、实验
1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个
1 2
2 4
3 6
4 8
5 10
6 16
7 32
64
1 0
2 0.5
3 1
4 2
5 4
6 6
7 8
10
0，按Enter键进入系统。电脑开机，密码为mby-nano，双击酶标仪软件图标，出
现登录
框，直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面
，若底物为TMB，
选择“铁动力学”(波长为
650nm)
，选择模
板1
打开电脑内置时
； 钟
，
若底物为
ABTS，则检验项目选择“gg”（波长为
405nm）
。
新建一个word文档，以日期命名，打开。
2、加样：96孔板从左至右编号为1-12，自上而下编号为A-H。以TMB为例，从第1列加样：
①从A1至H1，每孔加200µL NaAc/HAc Buf； ②从A1至H1，每孔加10µL催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）； ③从A1至H1，每孔分别加不同体积（0，0.5，1，2，4，6，8，10µL）TMB（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；
④用排枪吸取32µL H2O2加入A1至H1，快速放入酶标仪中，点击“读板”，记下读板时间（如下表所示，假设第一次读板时间为09：00：00） Code Time TMB
用排枪加H2O2时，注意检查枪头是否插紧，否则会导致吸取H2O2的量不足。亦可先将96孔板放入酶标仪，再加H2O2，这样可以节约时间。每次读板出来结果后，点击“结果入库”——>“是”——>“确定”，按下“PrintScreen”键，点击“退出”，打开word文档，ctrl+V或者右击选“粘贴”，保存结果，要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存，可点击“查询结果”，下拉框中选择目的模板编号即可。(现已可以直接拷吸光值读取数据，按ctrl键点击该处文字见方法)
3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将边上的液体擦干。第二、三、四组同第一组的操作。保存所有数据，拷贝到U盘里，整理实验台，关掉酶标仪、空调和电脑。
4、若当天不再继续实验，将24孔板中剩余的H2Oorigin,米氏方程拟合。origin,米氏方程拟合。
2倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水冲洗一次，放入烘箱中烘干。移液枪放回原处，催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。
三、数据处理
1、打开Origin6.1，点击右上角的“Add New Column”（箭头所指）：
1 00：00
0 2 00：30 0.5 3 01：00 1 4 01：30 2 5 02：00 4 6 02：30 6 7 03：00 8 03：30 10 ，亦可右击——> Add New Columnorigin,米氏方程拟合。
。
2、输入数据：命名各列，X列命名为时间，单位s，8个Y列分别为8个孔的编号。X列时间从0-180s，0 s对应微孔板编号1的数据，30 s对应code2的数据，以此类推，将所读数据输入。
点击“file”—>“Save Project As”，
米氏方程概述
篇二:origin,米氏方程拟合
米氏方程概述
v=Vmax×[S]/（Km+[S])，
这个方程称为Michaelis-Menten方程，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的，其中 Km 值称为米氏常数，Vmax是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。由此可见Km值的物理意义为反应速度（v）达到1/2Vmax时的底物浓度（即Km=[S]），单位一般为mol/L，只由酶的性质决定，而与酶的浓度无关。可用Km的值鉴别不同的酶。
当底物浓度非常大时，反应速度接近于一个恒定值。在曲线的这个区域，酶几乎被底物饱和，反应相对于底物S是个零级反应。就是说再增加底物对反应速度没有什么影响。反应速度逐渐趋近的恒定值称为最大反应速度Vmax。对于给定酶量的Vmax可以定义为处于饱和底物浓度的起始反应速度n。对于反应曲线的这个假一级反应区的速度方程可写成一种等价形式：
n（饱和时）=Vmax=k[E][S]0=k[E]total=k cat[ES]
速度常数k等于催化常数k cat，k cat是ES转化为游离的E和产物的速度常数。饱和时，所有的E都是以ES存在。方程（3.2）中还有另一个简单的关系式：Vmax=k cat [E]total。从中得出：k cat=Vmax / [E]total。k cat的单位是s－1。催化常数可以衡量一个酶促反应的快慢。
米氏常数Km是酶促反应速度n为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。这可通过用[S]取代米氏方程中的Km证明，通过计算可得n=Vmax /2。
（1）Km和Vmax的意义
① 当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。
② 当k-1>>k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。因此，Km可以反映酶与底物亲和力的大小，即Km值越小，则酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。 ③ Km可用于判断反应级数：
当[S]<0.01Km时，ν=（Vmax/Km）[S]，反应为一级反应，即反应速度与底物浓度成正比；
当[S]>100Km时，ν=Vmax，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；
当0.01Km<[S]<100Km时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应。
④ Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。
⑤ Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物。
⑥ Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：
当[S]=10Km时，ν=91%Vmax，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。 ⑦ Vmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。
Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-BurkHanes作图法。
（2） 双倒数作图
酶促反应中的Km和Vmax值有几种测量方法。
固定反应中的酶浓度，然后分析几种不同底物浓度下的起始速度，就可获得Km和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。
所以通常都是利用米氏方程的转换形式求出Km和Vmax值。
常用的米氏方程转换形式是Lineweaver-Burk方程，也称为双倒数方程。 使1/ v 对1/[S]作图，可以获得一条直线。从直线与x轴的截距可以得到1/Km的绝对值；而1/Vmax是直线与y轴的截距。双倒数作图直观、容易理解，为酶抑制研究提供了易于识别的图形。
（3） 抑制作用的影响 竞争性抑制
Km值增大，Vmax值不变 非竞争性抑制
Km值不变，Vmax值变小 反竞争性抑制
Km值变小，Vmax值变小，但Vmax/Km值不变
米氏方程______。 A.表述了Km与Vmax的关系B.表述了酶反应
篇三:origin,米氏方程拟合
一、整体解读
试卷紧扣教材和考试说明，从考生熟悉的基础知识入手，多角度、多层次地考查了学生的数学理性思维能力及对数学本质的理解能力，立足基础，先易后难，难易适中，强调应用，不偏不怪，达到了“考基础、考能力、考素质”的目标。试卷所涉及的知识内容都在考试大纲的范围内，几乎覆盖了高中所学知识的全部重要内容，体现了“重点知识重点考查”的原则。
1．回归教材，注重基础
试卷遵循了考查基础知识为主体的原则，尤其是考试说明中的大部分知识点均有涉及，其中应用题与抗战胜利70周年为背景，把爱国主义教育渗透到试题当中，使学生感受到了数学的育才价值，所有这些题目的设计都回归教材和中学教学实际，操作性强。
2．适当设置题目难度与区分度
选择题第12题和填空题第16题以及解答题的第21题，都是综合性问题，难度较大，学生不仅要有较强的分析问题和解决问题的能力，以及扎实深厚的数学基本功，而且还要掌握必须的数学思想与方法，否则在有限的时间内，很难完成。
3．布局合理，考查全面，着重数学方法和数学思想的考察
在选择题，填空题，解答题和三选一问题中，试卷均对高中数学中的重点内容进行了反复考查。包括函数，三角函数，数列、立体几何、概率统计、解析几何、导数等几大版块问题。这些问题都是以知识为载体，立意于能力，让数学思想方法和数学思维方式贯穿于整个试题的解答过程之中。
米氏方程
篇四:origin,米氏方程拟合
米氏方程与双倒数作图法Lineweaver-Burk plot 米氏方程（Michaelis-Menten Equation）或米曼氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）是由Leonor Michaelis和Maud Menten在1913年提出，是
酶学
中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象、表示一个酶促反应的起始速度V（有些资料中也称为Vo）与底物浓度[S]关系的速度方的方程，米氏方程形式如下：
其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。在酶促反应中，底物情况在低浓度下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为米氏方程的模拟作图：
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：
将1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值。示意图如下：