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米氏常数测定方法
篇一:origin拟合米氏方程
酶活米氏常数实验
一、实验前准备
1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。
2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200µL和10µL移液枪、50µL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。 4、记录本上提前写好实验的加样顺序：
催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液 ②10µL催化剂 ③底物TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10µL) ④32µLH2O2（排枪加） 催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液 ②10µL催化剂 ③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64µL） ④10µL底物TMB（ABTS）（排枪加）
数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。 Code Time TMB V01
Code Time H2O2 V01 二、实验
1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个
1 2
2 4
3 6
4 8
5 10
6 16
7 32
64
1 0
2 0.5
3 1
4 2
5 4
6 6
7 8
10
0，按Enter键进入系统。电脑开机，密码为mby-nano，双击酶标仪软件图标，出
现登录
框，直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面origin拟合米氏方程。
，若底物为TMB，origin拟合米氏方程。
选择“铁动力学”(波长为
650nm)
，选择模
板1
打开电脑内置时
； 钟
，
若底物为
ABTS，则检验项目选择“gg”（波长为
405nm）
。
新建一个word文档，以日期命名，打开。
2、加样：96孔板从左至右编号为1-12，自上而下编号为A-H。以TMB为例，从第1列加样：
①从A1至H1，每孔加200µL NaAc/HAc Buf； ②从A1至H1，每孔加10µL催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）； ③从A1至H1，每孔分别加不同体积（0，0.5，1，2，4，6，8，10µL）TMB（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；
④用排枪吸取32µL H2O2加入A1至H1，快速放入酶标仪中，点击“读板”，记下读板时间（如下表所示，假设第一次读板时间为09：00：00） Code Time TMB
用排枪加H2O2时，注意检查枪头是否插紧，否则会导致吸取H2O2的量不足。亦可先将96孔板放入酶标仪，再加H2O2，这样可以节约时间。每次读板出来结果后，点击“结果入库”——>“是”——>“确定”，按下“PrintScreen”键，点击“退出”，打开word文档，ctrl+V或者右击选“粘贴”，保存结果，要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存，可点击“查询结果”，下拉框中选择目的模板编号即可。(现已可以直接拷吸光值读取数据，按ctrl键点击该处文字见方法)
3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将边上的液体擦干。第二、三、四组同第一组的操作。保存所有数据，拷贝到U盘里，整理实验台，关掉酶标仪、空调和电脑。
4、若当天不再继续实验，将24孔板中剩余的H2O
2倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水冲洗一次，放入烘箱中烘干。移液枪放回原处，催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。
三、数据处理
1、打开Origin6.1，点击右上角的“Add New Column”（箭头所指）：
1 00：00
0 2 00：30 0.5 3 01：00 1 4 01：30 2 5 02：00 4 6 02：30 6 7 03：00 8 03：30 10 ，亦可右击——> Add New Column
。
2、输入数据：命名各列，X列命名为时间，单位s，8个Y列分别为8个孔的编号。X列时间从0-180s，0 s对应微孔板编号1的数据，30 s对应code2的数据，以此类推，将所读数据输入。origin拟合米氏方程。
点击“file”—>“Save Project As”，
米氏方程概述
篇二:origin拟合米氏方程
米氏方程概述
v=Vmax×[S]/（Km+[S])，
这个方程称为Michaelis-Menten方程，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的，其中 Km 值称为米氏常数，Vmax是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。由此可见Km值的物理意义为反应速度（v）达到1/2Vmax时的底物浓度（即Km=[S]），单位一般为mol/L，只由酶的性质决定，而与酶的浓度无关。可用Km的值鉴别不同的酶。
当底物浓度非常大时，反应速度接近于一个恒定值。在曲线的这个区域，酶几乎被底物饱和，反应相对于底物S是个零级反应。就是说再增加底物对反应速度没有什么影响。反应速度逐渐趋近的恒定值称为最大反应速度Vmax。对于给定酶量的Vmax可以定义为处于饱和底物浓度的起始反应速度n。对于反应曲线的这个假一级反应区的速度方程可写成一种等价形式：
n（饱和时）=Vmax=k[E][S]0=k[E]total=k cat[ES]
速度常数k等于催化常数k cat，k cat是ES转化为游离的E和产物的速度常数。饱和时，所有的E都是以ES存在。方程（3.2）中还有另一个简单的关系式：Vmax=k cat [E]total。从中得出：k cat=Vmax / [E]total。k cat的单位是s－1。催化常数可以衡量一个酶促反应的快慢。
米氏常数Km是酶促反应速度n为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。这可通过用[S]取代米氏方程中的Km证明，通过计算可得n=Vmax /2。
（1）Km和Vmax的意义
① 当ν=Vmax/2时，Km=[S]。因此，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。
② 当k-1>>k+2时，Km=k-1/k+1=Ks。因此，Km可以反映酶与底物亲和力的大小，即Km值越小，则酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。 ③ Km可用于判断反应级数：
当[S]<0.01Km时，ν=（Vmax/Km）[S]，反应为一级反应，即反应速度与底物浓度成正比；
当[S]>100Km时，ν=Vmax，反应为零级反应，即反应速度与底物浓度无关；
当0.01Km<[S]<100Km时，反应处于零级反应和一级反应之间，为混合级反应。
④ Km是酶的特征性常数：在一定条件下，某种酶的Km值是恒定的，因而可以通过测定不同酶（特别是一组同工酶）的Km值，来判断是否为不同的酶。
⑤ Km可用来判断酶的最适底物：当酶有几种不同的底物存在时，Km值最小者，为该酶的最适底物。
⑥ Km可用来确定酶活性测定时所需的底物浓度：
当[S]=10Km时，ν=91%Vmax，为最合适的测定酶活性所需的底物浓度。 ⑦ Vmax可用于酶的转换数的计算：当酶的总浓度和最大速度已知时，可计算出酶的转换数，即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。
Km和Vmax的测定：主要采用Lineweaver-BurkHanes作图法。
（2） 双倒数作图
酶促反应中的Km和Vmax值有几种测量方法。
固定反应中的酶浓度，然后分析几种不同底物浓度下的起始速度，就可获得Km和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。
所以通常都是利用米氏方程的转换形式求出Km和Vmax值。
常用的米氏方程转换形式是Lineweaver-Burk方程，也称为双倒数方程。 使1/ v 对1/[S]作图，可以获得一条直线。从直线与x轴的截距可以得到1/Km的绝对值；而1/Vmax是直线与y轴的截距。双倒数作图直观、容易理解，为酶抑制研究提供了易于识别的图形。
（3） 抑制作用的影响 竞争性抑制
Km值增大，Vmax值不变 非竞争性抑制
Km值不变，Vmax值变小 反竞争性抑制
Km值变小，Vmax值变小，但Vmax/Km值不变
米氏方程
篇三:origin拟合米氏方程
米氏方程与双倒数作图法Lineweaver-Burk plot 米氏方程（Michaelis-Menten Equation）或米曼氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）是由Leonor Michaelis和Maud Menten在1913年提出，是
酶学
中极为重要的可以描述多种非变异构酶动力学现象、表示一个酶促反应的起始速度V（有些资料中也称为Vo）与底物浓度[S]关系的速度方的方程，米氏方程形式如下：
其中，Vmax表示酶被底物饱和时的反应速度，Km值称为米氏常数，是酶促反应速度V为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。在酶促反应中，底物情况在低浓度下，反应相对于底物是一级反应（first order reaction）；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应（mixed order reaction）；当底物浓度增加时，反应由一级反应向零级反应（zero order reaction）过渡；当底物浓度[S]逐渐增大时，速度V相对于[S]的曲线为一双曲线。下图为米氏方程的模拟作图：
酶促反应中的米氏常数的测定和Vmax的测定有多种方法。比如固定反应中的酶浓度，然后测试几种不同底物浓度下的起始速度，即可获得Km和Vmax值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定Km或Vmax值是很困难的，因为曲线接近Vmax时是个渐进过程。因此，通常情况下，我们都是通过米氏方程的双倒数形式来测定，即Lineweaver-Burk plot，也可称为双倒数方程(double-reciprocal plot)：
将1/V 对1/[S]作图，即可得到一条直线，该直线在Y轴的截距即为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值。示意图如下：
实验一：米氏常数的测定
篇四:origin拟合米氏方程
双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数
学院/专业/班级____________________________________________ 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________
【实验目的】以过氧化物酶为例，掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法
【实验原理】1913年，Michaelis和Menten运用酶反应过程中形成中间络合物的原理，首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式，即著名的米氏方程：
vVmaxS 式中：v为反应初速率（微摩尔浓度变化/min）；Vmax为最大反应速率（微摩KmS尔浓度变化/min）；S为底物浓度（mol/L）；Km为米氏常数（mol/L）。这个方程式表明当已知Km及Vmax时，酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。Km值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度，是酶的特征常数之一。不同酶的Km值不同，同一种酶与不同底物反应Km值也不同，Km值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小：Km越大表明亲和力越小；Km越小表明亲和力越大。大多数纯酶的Km值在0.01100 mmol/L。通过米氏方程的不同变形，可有多种求算米氏常数的方法，一般较常用的双倒数法，即取米氏方程的倒数式：1Km111111以对作图得一直线，该直线与横轴截距。 vVmaxSVmaxSKmvS过氧化物酶是一种对氢受体（H2O2） 底物有特异性，对氢供体底物缺乏特异性的酶，它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应，可用于微量过氧化氢含量测定，也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。通常使用的过氧化物酶是从植物辣根中提取的，因此也称为辣根过氧化物酶（horseradish
peroxidase, HRP）。HRP属于含血红素蛋白的一种，是由辅基——氯化血红素（铁卟啉）和脱辅基蛋白（糖蛋白）组成，分子量为44000。
HRP是双底物酶（过氧化氢+多元酚或胺类底物），为求其对某一底物的Km，通常的做法是令另一底物的浓度相对于待测底物大大过量，即可把该酶促反应当作单底物反应来处理。本实验我们选用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）作为氢受体，它可被Hb催化过氧化氢氧化生成有色产物，该产物在反应条件下（pH5-7左右）为蓝色物质（max=650 nm）。实验中我们使TMB的浓度大过量，测定HRP对H2O2的Km值（反之亦可测定HRP对TMB的Km值）。
【实验仪器及试剂】
仪器：日立 UV-3010紫外可见分光光度计；石英比色皿（1 cm）：2只；100 L微量取样器1支（枪头若干）；1 mL取液器一支；电磁搅拌器1台（1 cm聚四氟乙烯搅拌子1个 ）
试剂：过氧化物酶（HRP溶液： mol/L；3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液（TMB）： mol/L（DMSO溶液）；H2O2溶液： mol/L；磷酸缓冲液（PBS）：pH= ； mol/L
【实验步骤】
在1 cm的比色皿（内置搅拌子）中加入1.7 mL PBS，然后在搅拌下，依次加入100 L HRP、TMB和不同量的H2O2溶液，马上移入样品架，记录650 nm处吸收峰强度随时间变化的曲线。（参比：1.7 mL PBS+100 L HRP+100 L TMB）
【数据记录与处理】
温度：______
【注意事项】 H2O2应该配置成不同浓度，加入相同体积为佳，但是由于动力学测定本身误差较大，且H2O2本身体积所占比例不大，故采取上述步骤。
【思考题】
1. 可查阅天然的过氧化物酶对H2O2的Km并与测定值进行比较
2. 初速率的测定应注意什么问题？本实验中初速率的单位为A（吸光度）/s（秒）与米氏方程中的单位并不相同，为什么不影响km的测定？如需测定Vmax，应如何进行？